Este primeiro caso de manipulação genética em um lagarto criou um organismo modelo que pode ajudar a obter uma maior compreensão da evolução e do desenvolvimento dos répteis.
CRISPR-Cas9 ou simplesmente CRISPR é um único, rápido e barato gene ferramenta de edição que permite a edição de um genoma, excluindo, adicionando ou alterando DNA. A sigla CRISPR significa 'Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats'. Esta ferramenta é simples e mais precisa do que os métodos anteriores usados para edição DNA.
A ferramenta CRISPR-Cas9 injeta organismos no estágio de zigoto (uma célula) com uma construção de DNA feita de (a) enzima Cas9 que atua como 'tesoura' e pode cortar ou excluir uma parte do DNA, (b) RNA guia - uma sequência que corresponde ao gene alvo e, portanto, orienta a enzima Cas9 para o local alvo. Depois que uma seção-alvo do DNA é cortada, o mecanismo de reparo do DNA da célula se junta novamente à fita remanescente e, no processo, silencia o gene-alvo. Ou o gene poderia ser "corrigido" usando um novo modelo de DNA modificado em um processo chamado de reparo direcionado por homologia. Assim, a ferramenta CRISPR-Cas9 permite modificações genéticas por injeção edição de genes soluções em um ovo fertilizado unicelular. Este processo causa uma alteração genética (mutação) em todas as células subsequentes que são produzidas, afetando assim a função do gene.
Embora o CRISPR-Cas9 seja usado rotineiramente em muitas espécies, incluindo peixes, pássaros e mamíferos, até agora não teve sucesso na manipulação genética de répteis. Isso se deve principalmente a duas barreiras. Primeiro, as fêmeas dos répteis armazenam espermatozoides por um longo prazo em seu oviduto, tornando difícil determinar o momento exato da fertilização. Em segundo lugar, a fisiologia dos ovos de répteis tem muitas características, como cascas de ovo flexíveis, fragilidade sem espaço de ar dentro, tornando difícil manipular os embriões sem causar ruptura ou danos.
Em um artigo carregado em bioRxiv em 31 de março de 2019, pesquisadores relataram o desenvolvimento e testes de uma forma de usar CRISPR-Cas9 edição gene em répteis pela primeira vez. A espécie de réptil escolhida no estudo foi uma espécie tropical lagarto chamado anolis sagrei ou mais comumente anole marrom que é comum no Caribe. Os lagartos do estudo foram coletados em uma região selvagem da Flórida, EUA. Esta espécie é ideal para o estudo devido ao seu tamanho diminuto, longa temporada de reprodução e tempo médio relativamente curto entre duas gerações.
Para superar as limitações enfrentadas atualmente com os répteis, os pesquisadores microinjetaram componentes do CRISPR em óvulos imaturos não fertilizados, enquanto os óvulos ainda estavam nos ovários das lagartas antes da fertilização. Eles tinham como alvo o gene da tirosinase, que produz uma enzima que controla a pigmentação da pele em lagartos e, se esse gene for removido, o lagarto nasceria um albino. Este fenótipo de pigmentação clara foi a razão para escolher o gene da tirosinase. Os óvulos microinjetados amadurecem dentro da fêmea e são posteriormente fertilizados naturalmente com um espermatozoide macho introduzido ou armazenado.
Como resultado, quatro lagartos albinos nasceram algumas semanas depois, confirmando que o gene da tirosinase foi desativado e o edição gene processo foi bem sucedido. Como a prole continha genes editados de ambos os pais, ficou claro que os componentes do CRISPR permaneceram ativos por muito mais tempo no ovócito imaturo da mãe e, após a fertilização, sofreram mutação nos genes paternos. Assim, lagartos albinos mutantes exibiram tirosinase manipulada em genes herdados da mãe e do pai, já que o albinismo é uma característica herdada de ambos os pais.
Este é o primeiro estudo a produzir efetivamente répteis geneticamente modificados. A pesquisa poderia funcionar de maneira semelhante em outras espécies de lagartos, como cobras, para as quais as abordagens atuais não tiveram sucesso até agora. Este trabalho pode ajudar a obter uma maior compreensão da evolução e desenvolvimento dos répteis.
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{Este estudo está sendo enviado para revisão por pares. Você pode ler a versão pré-impressa clicando no link DOI fornecido abaixo na lista de fontes citadas}
Fontes)
Rasys AM et al. 2019. Pré-impressão. CRISPR-Cas9 Edição Genética em lagartos por meio de microinjeção de oócitos não fertilizados. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
